Сперматозоидов с фрагментированной днк. Исследование на фрагментацию днк сперматозоидов. Как подготовиться к исследованию

ОЦЕНКА ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ

Повреждение спермальной ДНК означает потерю целостности структуры всей молекулы ДНК сперматозоида.

Термином «повреждение ДНК сперматозоидов» обозначают многие дефекты структуры хроматина, в том числе разрывы одной, или двух спиралей молекулы ДНК, делеции, или видоизменения, образование дополнительных связей в спирали, или между спиралями ДНК, и неправильное размещение протаминов из-за дефектного крослинкинга ДНК и белков .

Повреждение хроматина может произойти на любом этапе сперматогенеза , спермиогенеза , при прохождении через эпидидимис , а in vitro - во время подготовки сперматозоидов к искусственному оплодотворению.

Дефектные сперматозоиды, содержащие поврежденную ДНК, сохраняют способность к оплодотворению. Однако с такими повреждениями ДНК связаны некоторые формы бесплодия, например, идиопатическое бесплодие, повторяющиеся неудачи внутриматочной инсеминации (ВМИ) и ЭКО, привычные выкидыши. Более того, с повреждениями ДНК спермы связан повышенный риск раковых заболеваний и передающихся дефектов у потомства.

Из множества предполагаемых на сегодняшний день причин, вызывающих нарушение функции сперматозоидов, повреждение ядерной ДНК – наиболее изученная и все более признаваемая в качестве ключевого фактора, влияющего на качество эмбриона, его развитие и имплантацию. Вы можете ежедневно сдать анализ на фрагментацию ДНК в Лаборатории Клинической Андрологии.

Содержание статьи

1. Стоимость анализа на фрагментацию ДНК:
2. Способ определения микроповреждений ДНК
3. Терапия по восстановлению фрагментации ДНК
4. Спермограмма и тест на целостность структуры ДНК
5. Методы определения фрагментации ДНК
6. Преимущества использования TUNEL-теста
7. Показания к назначению фрагментации ДНК сперматозоидов
8. Опасности для ДНК сперматозоидов
9. Анализы на фрагментацию
10. Что это за исследование
11. Зачем его назначают
12. Порядок проведения и нюансы
13. Значение показателей
14. Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе
15. Патологическая фрагментация ДНК сперматозоидов – что это такое
16. Причины фрагментации ДНК
17. На что влияет повреждение хроматина в мужских половых клетках
18. Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест

Стоимость анализа на фрагментацию ДНК:

Повреждения спермальной ДНК связаны с параметрами спермограммы: снижением концентрации, подвижности и доли нормальных форм сперматозоидов. В то же время в 10-20% случаев могут иметь место при «нормозооспермии».

Ведущая причина повреждения ДНК – оксидативный стресс сперматозоидов , вызванный избыточной продукцией активных форм кислорода (см. рисунок по Aitken RJ et al., 2014).

Другая причина – незавершенный апоптоз сперматозоидов, связанный с нарушениями спермато- и спермиогенеза, и/или элиминацией дефектных форм в эпидидимисе.

По Aitken RJ et al. // Asian J Androl. 2014, 16 (1): 31.

Повреждение ДНК спермы - это многофакторный процесс, зависящий как от генетической предрасположенности, так и от внешних повреждающих факторов (курение, перегревание, токсические вещества и др.).

Поскольку это может иметь несколько причин, оценка фрагментации, оксидативного стресса и нарушений конденсации (упаковки) хроматина особенно рекомендуются для:

пар с историей выкидышей;

пар с необъяснимым бесплодием более 6 месяцев;

мужчин старше 40 лет;

пациентов с варикоцеле;

пациентов с системными заболеваниями (диабет, ожирение и др.);

мужчин с вредными факторами образа жизни (курение, ионизирующее излучение, токсические вещества, перегревание, в т.ч. при использовании облегающей одежды, несбалансированное питание и др.);

мужчин с историей рака и химиотерапией;

мужчин, проходящих лечение некоторыми рецептурными препаратами;

у мужчин, перенесших урогенитальные инфекции;

плохом качестве эмбриона во время повторных циклов донорства яйцеклеток;

мужском идиопатическом бесплодии.

Для обнаружений повреждений ДНК в сперматозоидах используют различные методы: дисперсии хроматина в агарозном геле (SCD), электрофореза ДНК после денатурации (COMET), терминальной метки (TUNEL) и др.

В таблице мы суммировали принципы и интерпретации наиболее широко используемых тестов.

Метод	П ринцип исследования	Размерность получаемых результатов	Нормальные значения
Метод TdT-опосредованной метки dUTP-конца разрыва цепи ДНК(метод TUNEL)	Измеряет степень повреждение ДНК путем включения встраивания ДНК зонда (модифицированного нуклеотида) в место повреждения ДНК	Доля сперматозоидов с повреждениями ДНК, которые несут модифицированый нуклеотид, встроенный в разрыв ДНК	Меньше 20 %,
Анализ структуры хроматина сперматозоида (метод SCSA)		Количество сперматозоидов с фрагментированной ДНК в %	Меньше 30 %
Анализ дисперсии хроматина сперматозоида (метод SCD)	Измерение подверженности ДНК к денатурации	Количество сперматозоидов с фрагментированной ДНК, %	Меньше 15%
Метод ДНК-комет (COMET)	Измерение подверженности ДНК к денатурации	Степень фрагментации ДНК в отдельном сперматозоиде оценивается по доле ДНК в хвосте кометы, длине хвоста и интенсивности окраски	Не определено
Окрашивание анилиновым синим и хромомицином А3	Измерение уровня компактизации хроматина сперматозоидов на основе соотношения гистонов и протаминов	Количество сперматозоидов с низкой компактизацией хроматина, %	Меньше 30% ИндексG0+G1+G2x2 меньше 40

Для оценки фрагментации ДНК исторически первым более 35 лет назад начали применять метод SCSA. Для научных целей наиболее часто применяют метод TUNEL, способный выявлять как одноцепочечные разрывы, так и двуцепочечные разрывы ДНК. Самый современный и удобный для клинического применения – метод SCD; некоторые считают его также самым чувствительным.

Конденсацию (упаковку) хроматина сперматозоидов оценивают по соотношению белков гистонов и протаминов в сперматозоидах, для чего применяют окраску анилиновым синим и хромомицином

Оригинальные фото из нашей лаборатории:

А- TUNEL; Б- SCD; В-гистоны/протамины

Обнаружение повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов требует лечения, направленного на устранение предполагаемого патогенетического фактора: инфекционно-воспалительных процессов, и даже бессимптомного носительства таких инфекций, как Chlamydia trachomatis, Mycoplasma sp., Ureaplasmаurealyticum, некоторых серотипов E.coli и др., перегревания яичек (в т.ч. связанного в варикоцеле), курения, действия некоторых лекарственных средств (paroxetine,miloxan, pentoxyphylline и др.), избыточного веса, нарушения углеводного обмена и др. В случае обнаружения оксидативного стресса – дополнительно применение различных нутриентов-антиоксидантов. В самых сложных случаях может быть полезным получение сперматозоидов непосредственно из яичек, где они защищены от действия активных радикалов гемато-тестикулярным барьером . Но в этом случае последующие неудачи ЭКО ИКСИ могут быть связаны с нарушением упаковки хроматина, поскольку необходимая для полноценного созревания сперматозоидов замена гистонов на протамины происходит уже в придатках яичек.

Последние годы для нормализации структуры хроматина сперматозоидов достаточно эффективно используются современные клеточные технологии, в т.ч. связанные с применением МСК и клеток Сертоли.

Доктор мед. наук, профессор В.А. Божедомов

Несколько цитат о значении фрагментации ДНК сперматозоидов:

«…В сперматозоидах у мужчин с олигозооспермией увеличивается повреждение ДНК. Это увеличение связано с уменьшением шансов естественной беременности и увеличением вероятности ранней потери беременности…»

Male Infertility / A. Jungwirth (Chair) et al. ©

European Association of Urology, 2017: 14.

«…Существует два типа фрагментации ДНК сперматозоидов, из которых один зависит от параметров спермограммы, а второй – нет...»

Muratori M. et al.// Hum. Reprod., 2008, V23 (5), p.1035-1043.

«…Дефектные сперматозоиды, содержащие поврежденную ДНК, сохраняют способность к оплодотворению. Однако с такими повреждениями ДНК связаны некоторые фенотипы бесплодия, например, необъяснимое и идиопатическое бесплодие, повторяющиеся неудачные ВМИ и ЭКО, и привычные выкидыши. Более того, с повреждениями ДНК спермы связан повышенный риск раковых заболеваний и передающихся дефектов у потомства…»

Sperm chromatin: biological and clinical application in male infertility and assisted reproduction / A.Zini, A.Agarwal (Ed.), 2011, Springer, 512.

«…Из множества предполагаемых на сегодняшний день причин, вызывающих нарушение функции сперматозоидов, повреждение ядерной ДНК – наиболее изученная и все более признаваемая в качестве ключевого фактора, влияющего на качество эмбриона, его развитие и имплантацию…»

Mallidis C. et al.// Hum Reprod., 2010, V.26, N7, P.1641-1649

«…Сперматозоиды с фрагментированной ДНК могут оплодотворять зрелые ооциты, но активация генома отцов может нарушать эмбриональное развитие, приводя к предимплантационным и постимплантационным потерям. Этот тип повреждения может возникнуть у эмбрионов с нормальным комплементом хромосом и, возможно, объяснить, почему некоторые эмбрионы с нормальными кариотипами не способны обеспечить беременность у пациентов с необъяснимыми выкидышами. В целом, чем больше степень повреждения ДНК передается эмбриону отцовским геномом, тем раньше этот ущерб будет проявляться во время развития эмбриона…»

Bareh Gihan M. еt al.// Fertility and Sterility, 2016, 105 (2): 15-282

«…Недавние исследования показали важность целостности ДНК спермы как важного фактора, который влияет на функциональную компетентность спермы. Поэтому обнаружение фрагментации ДНК сперматозоидов может быть клинически полезным, как часть процесса оценки фертильности … Тесты фрагментации ДНК спермы практически не имеют разницы в прогнозируемом значении между IVF и ICSI…»

Cissen M et al. Measuring Sperm DNA Fragmentation and Clinical Outcomes of Medically Assisted Reproduction: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One. 2016 Nov 10; 11(11):e0165125.

«…Современные модели на животных и экстраполяционные данные в исследованиях на людях вызывают озабоченность проблемами со здоровьем у потомства, полученного из спермы, с повышенным уровнем фрагментации ДНК...»

Bach PV, Schlegel PN. Sperm DNA damage and its role in IVF and ICSI. Basic Clin Androl. 2016, 5 (26): 15.

«…Уникальный процесс уплотнения хроматина в сперматозоиде имеет важные последствия как для развития скрининговых тестов мужского бесплодия, так и для понимания характеристик хроматина спермы, которые могут повлиять на результаты вспомогательных репродуктивных технологий...»

Palermo GD et al. Perspectives on the assessment of human sperm chromatin integrity. Fertil Steril. 2014 Dec; 102(6):1508-17.

“…Мета-анализ с двумерным случайным эффектом дал значение AUC (площадь под кривой) 0,92 с чувствительностью (доверительный интервал 95%) 0,80 (0,78-0,82) и специфичностью 0,83 (0,80-0,86) для использования теста SDF в дифференциации бесплодных мужчин от нормального фертильного контроля. Более того, анализ подгрупп показал, что анализ SDF с одним тестом TUNEL привел к величине AUC 0.9506 с объединенной чувствительностью 0.77 (0.74-0.8) и специфичностью 0.91 (0.87 - 0.94), в то время как тесты SCD и Comet отображали комбинированную чувствительность 0,77 (0,67-0,81) или 0,91 (0,88-0,94) и специфичность 0,84 (0,75-0,91) или 0,63 (0,54-0,70), сопровождаемая величиной AUC 0,84 или 0,94…»

Cui ZL et al. Diagnostic Accuracies of the TUNEL, SCD, and Comet Based Sperm DNA Fragmentation Assays for Male Infertility: a Meta-analysis Study. Clin Lab. 2015; 61(5-6): 525-35.

После проведения анализа сперматозоидов требуется определить процесс фрагментации ДНК. У многих мужчин возникает вопрос, что такое фрагментация сперматозоида.

Фрагментация ДНК сперматозоида – это процесс, в результате которого производится нарушение целостности цепочек нуклеиновых генетических клеток, расположенных в сперматозоиде. Если разрывы ДНК спирали увеличиваются, что целостность генетической информации нарушается. Это приводит к уменьшению вероятности возникновения беременности.

Способ определения микроповреждений ДНК

Лишь в единичных случаях яйцеклетка способна устранить некоторые дефекты ДНК спирали сперматозоида. Вероятность восстановления структуры генетического материала посредством яйцеклетки зависит от следующих факторов:

• Какой именно характер разрушения ДНК цепи.
• Какой процент генетического материала находится в поврежденном состоянии.
• Насколько качественна яйцеклетка, ведь именно от этого зависит возможность убрать дефекты характерные для ДНК спирали сперматозоида. В этом случае особое внимание следует уделить возрасту пациентки.

Отметим, что существует вероятность того, что результаты от одного донора будут отличаться в зависимости от времени сдачи. Величина фрагментации ДНК, как правило, изменяется в течение недели или месяца.

Терапия по восстановлению фрагментации ДНК

Ученые доказали, что для минимизации фрагментации ДНК следует использовать антиоксиданты. При этом следует учесть тот факт, что такие терапевтические мероприятия не дают результат в том случае, если фрагментация стала следствием длительного воздействия на организм токсичных веществ или высокой температуры. Под воздействием этих факторов производится нарушение ферментов каспазы и белков эндонуклеазы сперматозоида.

Врачи рекомендуют в таком случае извлекать сперматозоиды прямо из яичек, тогда удается получить материал, в котором процесс фрагментации протекает медленнее. Таким образом, получается материал более высокого качества.

Спермограмма и тест на целостность структуры ДНК

Отметим, что спермограмма определяет совсем другие характеристики сперматозоидов не обращая внимание на цепочку ДНК. Спермограмма делает основной упор на исследование физических характеристик семенной жидкости, ее насыщенности, подвижности сперматозоидов и их строение. В результате такой процедуры не производится диагностирование генетической структуры.

Определение причин разрушения ДНК сперматозоидов

На формирование целостной структуры ДНК сперматозоидов влияют внутренние и внешние факторы. Внутренние заключаются в следующем:

Внешние факторы, которые влияют на фрагментацию ДНК сперматозоидов:

• Ген повреждается посредством облучения рентгеновскими лучами или химиотерапией.
• Варикозное расширение вен, которое производилось в семенном канате.
• У мужчины наблюдалась высокая температура тела.
• Организм долгое время подвергался внешнему термическому воздействию.
• Наличие острого воспалительного процесса в течение долгого времени.
• Проявление оксидативного пост-тестикулярного стресса. Когда сперматозоиды движутся по эпидидимию, то может произойти фрагментация их ДНК. Эту причиной служит высвобождение сперматозоидами свободных радикалов, оказывающих негативное воздействие на формирование структуры ДНК. Также раздражение каспаз и эндонуклеаз может произойти под воздействием высокой температуры или воздействия токсичных веществ на организм мужчины.

Методы определения фрагментации ДНК

Для определения фрагментации ДНК сперматозоидов существует множество методов, каждый из которых отличается определенной степенью правдоподобности. Большой популярностью пользуется TUNEL-тест. Его рекомендуют использовать многие специалисты, которые на протяжении долгого времени работают в этой области.

Давайте более детально разберемся в вопросе, как же производится непосредственно фрагментация ДНК в спермограмме. В эякулят добавляется специальное вещество, а затем производится тщательное исследование спермы под микроскопом. Целью данного исследования является подсчет количества здоровых сперматозоидов, а также тех, которые имеют фрагментацию ДНК. Их внешний вид значительно разниться, поэтому специалист сможет безошибочно различить их по определенным параметрам.

Результат анализа выдается в виде фото, на котором находится изображение сперматозоидов. Также важный критерий – это процентное соотношение здоровых клеток к тем, которые имеют ярко выраженную фрагментацию ДНК. Заключение может выдать только квалифицированный в данной области специалист. При этом производится соотношение здоровых клеток, к тем, которые имеют структурные повреждения. Следует отдельно провести сравнение с показателями, которые соответствуют норме.

Преимущества использования TUNEL-теста

Главный плюс проведения исследования заключается в том, что производится тщательное изучение дефрагментации материала, производятся SCSA и SCD тесты, которые покажут возможные нарушения в формировании структуры ДНК и аномальные формы. Следует отметить, что прогноз таких анализов практически не производится. Тест выполняется для определения показателей, которые характерны мужчине сегодня. Прогнозирование можно производить только на основе выбранного курса лечения. Отметим, что этим тестом была отмечена норма патологий в эякуляте мужчины. Она составляет пятнадцать процентов.

TUNEL-тест предполагает исследование клеток при взаимодействии с энзимом. Это вещество при проникновении в сперматозоид производит его окрашивание в определенный цвет. На сегодняшний день чаще всего используется метод светлого поля или окрашивание оболочки ярким, мерцающим цветом. Последний метод получил название флюоресценции.

Показания к назначению фрагментации ДНК сперматозоидов

Для проведения подобного тестирования следует предварительно получить назначения своего лечащего врача. Он предписывается только в строго определенной ситуации.

Были выявлены основные показатели, которые служат основанием для назначения TUNEL-теста:

Исследование фрагментации ДНК – сложная и кропотливая процедура, которая производится для определения возможных причин отсутствия оплодотворения. Используется по назначению врача в соответствии с регламентом и правилами процедуры. Несет исключительно информативный характер.

Фрагментация ДНК спермограммы — это специальное разрушение нуклеиновых цепей в ДНК. Цепочки располагаются в головной части сперматозоидов. В ситуациях, когда разрывы стремительно распространяются, постепенно нарушается целостность строения ДНК. Итогом такого явления, как фрагментация, является отсутствие какой-либо способности к зачатию ребенка.

Хорошая спермограмма — подтверждение отсутствия бесплодия у мужчины.

Фрагментация ДНК может быть устранена непосредственно самой яйцеклеткой. Это явление объясняется тем фактом, что яйцеклетка имеет способность к восстановлению ДНК у оплодотворившего ее сперматозоида. Но случаи восстановления ДНК единичны. Яйцеклетка может восстановить нуклеиновую цепочку у сперматозоида в зависимости от следующих факторов:

• процентного отношения поврежденного генетического материала;
• особенностей и характера повреждения ДНК;
• особенностей самой яйцеклетки (в данном факторе важное место занимает возраст женщины).

Необходимо помнить, что исследование на целостность ДНК может показать неидентичные результаты через определенный интервал времени. Такого рода исследование на ДНК необходимо обязательно пересдавать в целях уточнения поставленного или предполагаемого диагноза. Как правило, пересдача осуществляется через 2-4 недели.

Опасности для ДНК сперматозоидов

Существует определенное количество неблагоприятных факторов, воздействующих на структуру цепочек ДНК у сперматозоидов. Различают внешние и внутренние факторы.

Внутренними факторами негативного влияния на ДНК являются:

1. Неверный отбор сперматозоидов. Сами они образуются непосредственно в семенниках. С самого начала своего развития они могут нести отклонения в строении и в генетике. В организме мужчины существует специальная система отбраковки. Именно она отбраковывает патологические сперматозоиды. Однако в некоторых ситуациях такая система может и не сработать. Результатом является проникновение в эякулят сперматозоидов с различными повреждениями в генетической структуре.
2. Неполное дозревание. Дозревание сперматозоидов постепенно происходит в придатках яичек. С течением времени в ядрах сперматозоидов начинает активироваться хроматин. Если дозревание по каким-то причинам не произошло, то ДНК мужских половых клеток серьезно повреждается.

Внешними причинами патогенного воздействия на структуру ДНК являются:

1. Рентгеновское облучение или химиотерапия больного.
2. Варикоз больного, развившийся в семенных канатиках.
3. Повышение температуры тела у больного.
4. Наличие воспалительных процессов, носящих острый характер течения.
5. Влияние токсичных веществ.
6. Посттестикулярный стресс у больного.

Нужно понимать, что прохождение мужских половых клеток через эпидидимий может также привести к явлению дефрагментации ДНК.

Анализы на фрагментацию

Для того чтобы определить наличие у пациента такого явления, как фрагментация ДНК сперматозоидов, необходимо провести ряд анализов и обследований. На сегодняшний день существует несколько методик для выявления данной патологии генетического материала, а именно:

1. TUNEL-тест. Для его проведения необходимо, чтобы пациент поспешил сдать сперму, к которой добавляются специальные химические реагенты. Анализ пробы осуществляется микроскопически. Результат теста предоставляется человеку вместе со снимком сперматозоидов. В комплекте результатов имеется специальная анкета-выписка с указанием количества здоровых и пораженных сперматозоидов. Сдать данный анализ рекомендует лечащий врач. Кроме того, врач описывает сложившуюся ситуацию и дает письменное заключение, в листке которого должно быть указано, превышена ли норма присутствующих в сперме фрагментированных сперматозоидов.

Преимуществами данного теста являются следующие моменты:

• анализ показывает реальные и корректные показатели;
• высокий спектр прогнозирования;
• пороговая величина теста достигает более 15%;
• энзим, который добавляют к сперматозоидам, окрашивает фрагментированные клетки.

Показания к проведению TUNEL-теста:

• бесплодие без ясной этиологии явления;
• отрицательные попытки искусственного оплодотворения;
• частые выкидыши;
• варикоз семенных канатиков;
• возраст мужчины более 45 лет;
• после замораживания спермальной жидкости;
• сильное повышение температуры тела в течение 90 дней.

2. Спермограмма. Благодаря данному методу исследования можно достаточно быстро выяснить причину нарушения фертильности у мужчины. Спермограмма исследует разнообразные параметры семенной жидкости. Наиболее важными параметрами спермограммы являются:

• объем материала;
• pH материала;
• морфология семенной жидкости;
• подвижность сперматозоидов.

Спермограмма дополнительно представляет корректные сведения о следующих данных:

• число лейкоцитов (в норме менее 1 млн на мл);
• МАР-тест (должен быть менее 10%);
• временной промежуток разжижения семенной жидкости (нормой является период от 30 до 60 минут);
• запах (ощущение наподобие каштанового);
• оттенок образца спермы, которая должна быть беловатой (допускается присутствие слегка розового цвета).

Нормой значений результатов спермограммы по ВОЗ являются:

• объем спермы от 2 мл;
• pH в пределах 7,2-8,0;
• концентрация семенной жидкости равна 20 млн на мл;
• количество сперматозоидов более 4 млн;
• подвижность сперматозоидов более 50%;
• более 30% сперматозоидов должны иметь нормальную форму.

Таким образом выглядит правильная спермаграмма. В иных ситуациях по результатам проведенного исследования врач внимательно проводит описание семенной жидкости.

Где можно сделать спермограмму?

В настоящее время спермограмма делается исключительно в больничных условиях. Этим анализом занимаются как частные клиники и специализированные лаборатории, так и государственные больницы. Собирать сперму при этом можно дома или в больнице. При осуществлении такой процедуры необходимо выполнять следующие условия сбора и сдачи материала:

• не вести половую жизнь 4 дня перед проведением спермограммы;
• не употреблять алкогольные напитки за сутки до анализа;
• при сборе спермы на дому необходимо сдать ее как можно быстрее в больницу (разрешается в течение 1 часа);
• семенная жидкость собирается в стерильную баночку (в презерватив собирать запрещено).
• собрать семенную жидкость необходимо с помощью применения мастурбации.

Анализ проводится достаточно быстро с момента сдачи спермограммы. Все условия должны быть соблюдены, поскольку они напрямую влияют на результат.

Тест HALO как лучшая методика проведения фрагментации

Сущность данного теста заключается в исследовании хроматина сперматозоидов. Благодаря ему можно достаточно точно определить индекс фрагментации. Фрагментация ДНК может встречаться у 25% мужчин. Они годами могут лечиться от бесплодия и не подозревать при этом, что является настоящей причиной такого состояния. Фрагментация ДНК, определяемая тестом HALO, дает полное понимание сущности проблемы бесплодия мужчины. В тесте учитываются и изучаются исключительно сперматозоиды.

Для проведения анализа необходимо сдать сперму. Расшифровка результатов исследования может выглядеть следующим образом:

1. Фрагментация до 15% — беременность возможна. Лучшее процентное содержание сперматозоидов.
2. Фрагментация 15-25% — беременность возможна, но потребуется время или ЭКО.
3. Фрагментация более 30% — рекомендовано ЭКО.
4. Фрагментация более 50% — рекомендовано ИКСИ;
5. Фрагментация более 60% — рекомендовано ИКСИ или семенная жидкость донора.

Следует отметить, что стоимость такого анализа невысокая.

Основным маркером мужской фертильности является целостность клеток в сперматозоидах. Если она отвечает всем медицинским требованием, то представитель сильного пола без проблем и длительных попыток может рассчитывать на желанную беременность у своей второй половины. Но если параметры имеют кардинальные отличия от нормативов, могут быть серьезные проблемы с плодовитостью. Выяснить это поможет специальный анализ, который должен пройти любой мужчина, заинтересованный в продолжении своего рода, – тест «фрагментация ДНК сперматозоидов».

Что это за исследование

Для того чтобы сперма имела способность к оплодотворению, необходимо чтобы каждый сперматозоид имел нормальную форму и подвижность. В природе абсолютных идеалов не бывает, но существуют границы нормы, при повышении которых анализ покажет, что мужская половая клетка не способна оплодотворить яйцеклетку. Отсутствие нормальной формы, которую должна иметь клетка, называется фрагментация. Чтобы представлять, какой процент имеет фрагментация в ДНК спермы, мужчина должен сделать специальный лабораторный анализ, при котором сперма изучается специалистами под микроскопом.

Если спермограмма покажет, что содержание фрагментированных сперматозоидов менее 15%, – значит, мужчина вполне способен к зачатию. Но если анализ фрагментации в ДНК у сперматозоидов говорит о том, что их более 30 процентов, – мужчина с большой вероятностью является бесплодным.

Зачем его назначают

Тест, показывающий содержание сперматозоидов с разрывами, редко проводится без наличествующих показаний. Самой главной причиной, по которой мужчина делает анализ, демонстрирующий фрагментацию ДНК сперматозоидов, – это бесплодные попытки зачать младенца. В этом случае пара обращается к врачу с просьбой назначить анализ, чтобы выяснить, кто из партнеров является «виновником» бездетности.

В иных ситуациях зачатие происходит, но после него следуют спонтанные выкидыши. И, наконец, тест на фрагментацию необходим, если пара решилась на процедуру экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), и важно владеть информацией, не нарушена ли половая клетка, которой будет оплодотворена женская яйцеклетка. В данном случае анализ является обязательным.

Таким образом, любой мужчина, планирующий детей, должен пройти тест и узнать, не является ли фрагментация ДНК спермограммы выше установленной нормы в 30 процентов. Тем более что анализ для сильной половины человечества технически проще, чем на фертильность для девушек.

ДНК фрагментацию проводят для выявления сперматозоидов с разрывами.

Порядок проведения и нюансы

Для того чтобы сдать тест, мужчина должен пройти предварительную подготовку. На протяжении как минимум трех дней он должен воздерживаться от половых контактов, в том числе от мастурбации, не употреблять алкоголь, не посещать сауны и не принимать горячие ванны. Таким образом, лаборант при исследовании сможет увидеть реальную картину, не искаженную внешними факторами.

Режим питания должен оставаться прежним, но в случае приема лекарственных препаратов, потенциально влияющих на фрагментацию ДНК, нужно обязательно сообщить об этом врачу и при возможности отменить их на время подготовки, чтобы анализ получился максимально точным. Такая инструкция дается каждому пациенту клиники, проводящей исследование, чтобы тест не нужно было проводить снова.

В день сдачи материала необходимо помочиться, а после собрать сперму в специальную емкость путем мастурбации. Затем анализ нужно незамедлительно отвезли в лабораторию, выполняющую тест, демонстрирующий, насколько спермограмма соответствует нормальным показателям, не имеют ли место различные отклонения.

Тест, в ходе которого определяется фрагментация в ДНК у сперматозоидов, имеет различную стоимость, в зависимости от города, региона и клиники, в которой проводилась спермограмма. В среднем, тест стоит от 8000 до 10000 рублей.

Значение показателей

Сдав тест, пациент получает распечатку, где продемонстрирована спермограмма и указана вся актуальная информация, которую выявил анализ после того как сперма была рассмотрена в микроскоп.

Таким образом, анализ здорового мужчины, сперма которого обладает нормальными показателями, имеет следующие нормативы:

• Концентрация семени 20 млн/мл.
• Лейкоциты в пределах 1 млн/мл.
• Подвижность клеток более 50%.
• Количество материала более 2 мл.
• Сперма разжижается за время 30-60 минут.
• Сперма имеет белесый оттенок.
• РН 7,2 – 8,0.
• Сперма имеет специфический запах, напоминающий запах каштана;

Для более точных результатов, сдавать сперму на анализы нужно несколько раз.

Если анализ выявляет, что спермограмма выглядит в пределах указанных значений, значит, тест говорит о том, что репродуктивная система здорова. Но наиболее актуальной информацией, которую дает тест, является уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. В соответствующей графе, которую будет иметь анализ, будет указана фрагментация ДНК сперматозоида в процентном соотношении.

Показатели, которые выявила спермограмма, могут иметь положительные результаты, отрицательные и удовлетворительные. То есть пациент лаборатории имеет шанс узнать, способен ли он стать биологическим отцом ребенка, может ли он это сделать естественным путем, при помощи ЭКО, ИКСИ либо его плодовитость исключат шансы на отцовство.

1. Хороший результат имеет тест, если спермограмма выявила отклонения на ДНК в соотношении 0-15%. Такое процентное соотношение говорит о том, что сперма хорошего качества, что практически каждая клетка готова к оплодотворению, то есть такой человек, говоря медицинским языком, фертилен.
2. Удовлетворительный итог имеет анализ, если спермограмма выявила, что коэффициент 16-30%, то есть, в среднем, каждый пятый сперматозоид имеет отклонения. Способен ли представитель сильного пола, у которого такая сперма, зачать плод? Теоретически, это вполне реально, но паре придется настроиться на длительную череду попыток. Если возраст пары это позволяет, проблема считается исчерпанной. Если же женщина находится на пределе своей естественной фертильности по возрастным критериям, то плохое качество семени может поспособствовать тому, что сперматозоид так и не оплодотворит яйцеклетку, то есть беременность не наступит. В этом случае такая спермограмма является поводом для направления на ЭКО: в лаборатории выберут сперматозоид и оплодотворят яйцеклетку женщины экстракорпоральным методом.
3. И, наконец, отрицательный анализ на плодовитость мужчина получит, если тест покажет, что деформация половой клетки, которую выявила спермограмма, – 31-50%. Это означает, что сперма едва ли способна оплодотворить девушку, и единственный метод, который позволит зачать ребенка, – процедура ЭКО. Однако важно помнить, что если явление будет превышать 29 процентов, шансы на удачное ЭКО будут средними.
4. Показатель 50-60%, который дает увидеть спермограмма, говорит о том, что мужчина не может рассчитывать даже на ЭКО, чтобы стать отцом. Правда, такой отрицательный тест иногда дает возможность воспользоваться ИКСИ – когда сперма вводится инъекционно в цитоплазму девушки.
5. Если анализ подводит итог, что спермограмма выявила нарушения более чем в 60%, шансов на генетическое отцовство нет.

Важно помнить, что сперма изменяет свой состав под воздействием различных факторов, в том числе терапевтических. Поэтому при правильно назначенном и проведенном лечении остается шанс на то, что в следующий раз спермограмма покажет более высокий результат фертильности, то есть сперма будет иметь малое число поврежденных клеток. Поэтому своевременное обследование в кабинете у врача можно смело назвать залогом успешного планирования семьи и продолжения рода.

Фрагментация ДНК сперматозоидов — что это за анализ? Показания, расшифровка Tunel-теста и прогнозы на беременность

Исследование фрагментации ДНК спермы – достаточно актуальная тема, если рассматривать проблему с точки зрения мужского бесплодия и бесплодных браков. В ряде случаев классической спермограммы бывает недостаточно (даже при ее хороших показателях), возникает необходимость в дополнительном ультраструктурном исследовании. Именно таким анализом является тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов. Делают анализ несколькими методиками, но наиболее часто используют исследование фрагментации ДНК в сперматозоидах методом Тунель (Tunel-тест).

• Сперматогенез
• Что такое фрагментация ДНК сперматозоидов
• Причины
  • Предрасполагающие факторы
• На что влияет повреждение хроматина
• Тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов
  • Расшифровка
• Высокий индекс фрагментации и привычное невынашивание
• Как снизить фрагментацию ДНК спермы
  • Хирургическое лечение варикоцеле
  • Пероральные антиоксиданты
• Кому сдавать анализ «Спермограмма с фрагментацией ДНК в сперматозоидах»
• Суть исследования
• Подготовка к сдаче анализа

Что такое физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов в сперматогенезе

В организме человека сперматозоид – самая маленькая клетка. Для уменьшения его размера в процессе сперматогенеза (созревания спермия и превращения в зрелый сперматозоид) происходит специфическое преобразование. Ядро уплотняется за счет механизма конденсации хроматина. Большая часть цитоплазмы «выбрасывается» из мужской половой клетки в виде «цитоплазматической капли», остаются только необходимые органеллы.

Схематичное изображение упаковки ДНК в хромосому

Для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы необходимы белки гистоны. Из ядра будущего сперматозоида удаляются гистоны, а ДНК связывается с белками-протаминами. Это позволяет плотно конденсировать хроматин и уменьшить ядро сперматозоида. В это время происходит «расплетание» участков ДНК и на стадии созревания они должны снова соединиться, но это происходит не всегда. У части сперматозоидов этот процесс остается незавершенным – это физиологическая фрагментация ДНК сперматозоидов. У здоровых мужчин степень фрагментации не превышает 15%.

Патологическая фрагментация ДНК сперматозоидов – что это такое

У бесплодных мужчин индекс сперматозоидов с нарушением целостности хромосом более 30%. При фрагментации ДНК спермы больше 30% вероятность наступления беременности крайне низкая, а ранние потери беременности высокие (замирание, самопроизвольные аборты, и т. д.).

Причины фрагментации ДНК

Выделяют 2 группы причин нарушенной целостности хромосом в мужских половых клетках:

1. Внутренние дефекты сперматогенеза (аномалии развития и генетические дефекты).
2. Внешние повреждения тестикул (опосредованное влияние гонадотоксинов, гипертермии, оксидативного стресса, эндокринных заболеваний).

Непосредственно в этих случаях влияют дефицит протаминов, активные формы кислорода, нарушение механизмов апоптоза, нарушения замены гистонов на протамины в сперматидах, плохая упаковка хроматина, усиление чувствительности к оксидативному стрессу дефектных сперматозоидов.

Факторы, приводящие к фрагментации ДНК сперматозоидов

К увеличению степени фрагментации ДНК приводят:

• лейкоспермия – повышенное количество лейкоцитов (воспалительные процессы, скрытые половые инфекции);
• возраст после 35 лет;
• привычки или стиль жизни: алкоголь, табакокурение;
• внешние факторы: пестициды в продуктах питания, работа на химическом производстве, повышенная температура на рабочем месте, влияние радиации;
• неопластические патологии: лейкемия, лимфома, рак яичек и химиотерапия;
• патологические процессы: повышение температуры тела, варикоцеле, генитальные инфекции, перекрут яичка, крипторхизм, слабый сперматогенез.
• генетические факторы: нарушения ДНК-репарации, антиоксидантные гены, путь детоксикации, аберрации и микроделеции.

На что влияет повреждение хроматина в мужских половых клетках

Повышенный процент фрагментации ДНК сперматозоидов:

• снижает фертильный репродуктивный потенциал мужчины;
• снижает частоту наступления беременностей;
• увеличивает репродуктивные и естественном оплодотворении, особенно на ранних сроках;
• снижает эффективность программ ВРТ (неудачное ЭКО и ВМИ).

Кроме того, измененная ДНК приводит к хромосомным нарушениям у детей, уменьшает срок жизни потомства, способствует развитию врожденных генетических дефектов у детей.

Анализ (тест) на фрагментацию ДНК сперматозоидов: оценка результатов и расшифровка Tunel-тест

Существует несколько методик для определения индекса фрагментации ДНК:

• Tunel;
• Halosperm;
• SCSA.

Наиболее прогностически значимым признано исследование фрагментации ДНК в сперматозоидах методом Tunel, но экономически более выгоден Halosperm. Наиболее часто тест проводится методами Tunel, Halosperm.

Расшифровка фрагментации ДНК в спермограмме представлена в таблице 1.

Таблица 1. Индекс фрагментации

Уровень фрагментации	Расшифровка и рекомендации
0-15%	Норма. Естественная беременность представляется возможной
15-25%	Естественная беременность возможна, но ее ожидание может затянуться. Если , рекомендуют проведение внутриматочной инсеминации. Если параллельно у женщины есть патологии репродуктивной сферы – следует .
> 30%	Наступление беременности маловероятно, шансы увеличатся, если прибегнуть к экстракорпоральному оплодотворению.
>50%	Беременность при применении ЭКО маловероятна. Рекомендовано .
>60%	Шансы очень малы, единственный выход – или .

Фрагментация ДНК сперматозоидов и привычное невынашивание беременности

• идиопатическом бесплодии (когда причина неизвестна);
• после множественных неудачных попыток ЭКО;
• получении в протоколе ЭКО эмбрионов невысокого качества;
• привычном невынашивании и неоднократных выкидышах;
• варикоцеле;
• мужчинам после 45 лет;
• после (для : необходимо убедиться, что процент клеток с поврежденной ДНК не превышает нормы);
• высокой температуре, наблюдаемой в последние 3 месяца.

Патофизиологические процессы, приводящие к повреждению ДНК, не до конца изучены. Определенная схема лечения бесплодия, вызванная этим фактором, пока не разработана. А методы репродуктивной медицины не всегда позволяют достичь положительного результата. Но нормализация структуры ДНК сперматозоидов позволяет улучшить и увеличить частоту клинических беременностей.

Суть метода Tunel

Для проведения теста сперму . Из образца биоматериала часть используется для светооптического исследования, где оцениваются морфологические качества сперматозоидов и состав спермы. Часть исследуется по методу Tunel.

В пробу для оценки фрагментации добавляют раствор меченных флюоресцирующих нуклеотидов, которые способны связываться с обрывками нитей ДНК. Нуклеотиды встраиваются в разорванную цепочку и выступают в качестве меток, которые флуоресцируют под микроскопом. Затем высчитывается процентное содержание «меченых» сперматозоидов и выдается результат.

Как подготовиться к исследованию

Перед сбором биоматериала действуют те же требования, как и перед с :

• Половое воздержание не менее 2 и не более 7 дней. Лучшее время – 3 суток. Если сдается анализ повторно, то лучше чтобы промежутки воздержания были одинаковыми.
• Отказ от алкоголя, курения, перегревания (сауны, бани и т.д.) сроком 3 месяца (весь процесс сперматогенеза длится в среднем 72 дня).
• Прекращение приема любых лекарственных препаратов, если врачом не указано обратное и нет угрозы жизни из-за прерывания терапии.
• Если мужчина перенес ОРВИ, грипп и другие заболевания с повышением температуры тела – сдачу анализа необходимо перенести.
• Накануне исключить физические и эмоциональные нагрузки.

Весь период подготовки необходимо правильное питание и соблюдение питьевого режима (1,5-2 литра в день).

Необходимо понимать, что качественные характеристики мужских половых клеток меняются во времени, в отличие от женских. Поэтому, точность результатов зависит от того, насколько вы серьезно подойдете к вопросу подготовки и лечению (для повторного теста на фрагментацию).